BAB III
METODE PERCOBAAN
III.1 Alat
Alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah erlenmeyer, otoklaf, neraca analitik, shaker, sendok tanduk, aluminium foil, botol sampel, cawan petri, pinset, bunsen, gegep, kantong plastic, ose bulat, kain kasa, kapas, preparat, deck gelas, dan mikroskop.
III.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah Akuades, Alkohol 70%, ALS (Air Laut Sintetik) : NaCl 32 g/l; KCL 0,75 g/l; MgSO4 3,91 g/l; MgCl2 6H2O 10,85 g/l; Tris 6,05 g/l; CaCl2 2H2O 1,47 g/l; NH4Cl 3,74 g/l; K2HPO4 0,93 g/50ml; FeSO4 0,5 g/50ml, ALN (Air Laut Natural), Nutrien Agar (NA)/Marine Agar, Petroleum, cristal violet (Gram A), larutan mordan lugol’s iodine (Gram B), larutan alkohol aseton (Gram C), larutan safranin (Gram D), Bakteri yang berasal dari : Air permukaan dan sedimen pelabuhan, sedimen dan air permukaan kanal, sedimen dan permukaan air laut pantai Losari.
III.3 Prosedur Kerja
III.3.1 Sterilisasi Alat
Sterilisasi dilakukan dengan penyemprotan menggunakan alcohol 70% misalnya saja pada sendok tanduk, deck gelas, preparat dsb. Adapula yang dilakukan dengan melidahapikan misalnya saja pada ose bulat dan permukaan cawan petri yang telah terdapat mikroba di dalamnya. Selanjutnya oleh enkas, Enkas disterilkan dengan menggunakan alkohol 70%. Alat-alat yang digunakan dimasukkan ke dalam enkas kemudian dinyalakan bunsen di dalamnya, ditutup dan dibiarkan selama 15 menit untuk mencegah terjadinya kontaminasi dengan organisme lain.
III.3.2 Pembuatan Medium
A. Pembuatan ALS
Disiapkan semua alat dan bahan. Dilakukan dengan pencampuran bahan Air Laut Sintetik untuk 32%o , yaitu : NaCl 32 g/l; KCL 0,75 g/l; MgSO4 3,91 g/l; MgCl2 6H2O 10,85 g/l; Tris 6,05 g/l; CaCl2 2H2O 1,47 g/l; NH4Cl 3,74 g/l, K2HPO4 0,93 mg/ml, FeSO4 50 mg/ml. Dilarutkan semua bahan tersebut ke dalam 100 ml aquadest kemudian disterilkan dengan menggunakan otoklav pada suhu 121oC pada tekanan 2 atm selama 15 menit.
B. Pembuatan FeSO4 dan K2HPO4
FeSo4 ditimbang sebanyak 50mg, lalu dilarutkan dalam akuades 50 ml dan ditambahkan 2-3 tetes H2SO4 / NaOH agar tidak teroksidasi. Selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml. Disterilkan menggunakan otoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC pada tekanan 2 atm
K2HPO4 ditimbang sebanyak 0,93 mg, lalu dilarutkan dalam akuades 50 ml dan ditambahkan 2 – 3 tetes H2SO4/NaOH agar tidak teroksidasi. Selanjutnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml dan disterilkan dengan menggunakan otoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC pada tekanan 2 atm.
C. Nutrien Agar (Marien Agar)
Untuk komposisi 100 mL : Ekstrak yeast 0,5 gram; Pepton 0,5 gram; Agar 2 gram; Akuadest 100 mL, dilakukan dengan cara
menimbang Ekstrak yeast sebanyak 0,5 gr, pepton 0,5 gr, agar 2 gr, dan ALS sebanyak 100 mL. Memasukkan potongan daging dan akuadest tadi ke dalam erlenmeyer kemudian mendidihkannya pada penangas. Setelah mendidih, mengangkat larutan tersebut dan menyaring ekstraknya dengan menggunakan kertas saring dan corong lalu memasukkannya ke dalam erlenmeyer. Menambahkan pepton dan agar lalu menambahkan ALS hingga volumenya 100 mL dan mengaduknya. Memanaskan kembali hingga mendidih dan homogen lalu mengangkat dan menutup mulut erlenmeyer dengan menggunakan aluminium foil. Menaruhnya dalam otoklaf dengan tekanan 2 atm selama 15- 20 menit. Menyimpan di dalam lemari pendingin.
III.3.3 Isolasi Bakteri Laut Pada Hidrogen
Sebelum dilakukan isolasi terlebih dahulu dilakukan sterilisasi pada enkas selama 15 menit. Setelah itu, FeSO4 diambil 0,2 ml sebanyak menggunakan pipet tetes lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer berisi ALS 23 ‰. Kemudian K2HPO4 diambil sebanyak 0,4 ml menggunakan pipet tetes lalu dimasukkan ke dalam elenmeyer yang berisi ALS 23 ‰, dan petroleum sebanyak 1 ml diambil kemudian dicampur ke dalam erlenmeyer tadi. Setelah itu, dimasukkan sebanyak 1 ml sampel air permukaan kanal ke dalam erlenmeyer lalu ditutup dengan kain kasa yang berisi kapas. Cara kerja yang sama juga dilakukan untuk sampel air laut pantai dan salinitas ALS yang sama yaitu 23 ‰. Setelah itu, diinkubasi selama 5 -7 hari menggunakan shaker pada suhu kamar.
III.3.4 Tahap Kultur
Bakteri yang mampu mendegradasi hidrokarbon diambil untuk ditumbuhkan kembali. Enkas disterilkan terlebih dahulu lalu FeSO4diambil 0,2 ml sebanyak menggunakan pipet tetes lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer berisi ALS 23 ‰. Kemudian K2HPO4diambil sebanyak 0,4 ml menggunakan pipet tetes lalu dimasukkan ke dalam elenmeyer yang berisi ALS 11 ‰, dan petroleum sebanyak 1 ml diambil kemudian dicampur ke dalam erlenmeyer tadi. Setelah itu, dimasukkan sebanyak 0,3 ml isolate bakteri yang baik ke dalam erlenmeyer lalu ditutup dengan kain kasa yang berisi kapas. Cara kerja yang sama juga dilkaukan pada ALS dengan salinitas yaitu 23 ‰ dan 32 ‰. Setelah itu, diinkubasi lagi selama 5-7 hari di atas shaker (suhu kamar) dan diamati pada salinitas berapa pertumbuhan bakteri pendegredasi hidrokarbon petrolium lebih efektif.
III.3.5 Pewarnaan Gram
Dilakukan sterilisasi preparat selama 10 detik dan ose bulat hingga membara. Diambil bakteri dalam cawan petri dengan penggosesan permukaan nutrient agar menggunakan ose bulat. Tambahkan akuades diatas preparat tersebut yang telah terdapat bakteri, kemudian sterilisasi hingga mengering (jangan sampai sampel menjadi hangus) Pewarnaan gram A, dengan cristal violet yang diteteskan pada permukaan preparat, didiamkan, kemudian di bilas menggunakan akuades. Pewarnaan gram B, dengan JKJ yang diteteskan pada permukaan preparat, didiamkan, kemudian di bilas menggunakan akuades. Pewarnaan gram C, dengan alcohol asam yang diteteskan pada permukaan preparat, didiamkan hingga 20 atau 30 detik, kemudian di bilas menggunakan akuades. Pewarnaan gram D, dengan safranin yang diteteskan pada permukaan preparat, didiamkan hingga 30 detik, kemudian di bilas menggunakan akuades. Mengamati di bawah mikroskop dengan pembesaran kuat dengan bantuan minyak imersi. Kemudian diperhatikan dan ditentukan bakteri yang terlihat, apakah termasuk bakteri gram positif atau negatif.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Gambaran umum lokasi pengambilan sampel
Pengambilan sampel dilakukan di Pelabuhan Paotere dan Pantai Losari. Sampel yang diambil di Pelabuhan Paotere yaitu berupa air permukaan dan sedimen berada pada daerah yang banyak mengandung tumpahan limbah petroleum di laut yang mungkin berasal dari buangan kapal yang berada di sekitar perairan tersebut. Sampel permukaan air kanal, dan sedimen kanal dimana letak air kanal ini tidak jauh dari pelabuhan tersebut. Sedangkan sampel yang diambil di Pantai Losari yaitu air permukaan dan sedimen. Hal ini dilakukan untuk melihat perbandingan bakteri yang dihasilkan dari kedua daerah tersebut.
I.2 Teknik pengambilan sampel
Menyediakan 6 botol sampel dan alkohol 70 %. Sebelum mengambil sampel alat-alat yang digunakan harus disterilkan dulu agar tidak terkontaminasi dengan bakteri lain dengan menggunakan alkohol 70%. Setelah itu mengambil sampel permukaan air laut secara hati – hati dengan menggunakan botol sampel dan menutupnya kembali. Demikian halnya pada bagian sedimen juga dilakukan hal yang sama yakni mengeruk sedimen dengan botol sampel dibawah agar sedimen masuk ke dalam botol, setelah sedimen masuk kemudian langsung ditutup kembali. Perlakuan yang sama juga digunakan pada air kanal dan pantai Losari.
IV.3 Isolasi bakteri laut pendegredasi hidrocarbon (HC)
Untuk isolasi bakteri, sampel yang telah diambil kemudian di bawah ke laboratorium untuk diteliti lebih lanjut mengenai bakteri pendegredasi HC. Mula-mula dibuat media air laut sintetik (ALS) yakni media yang dibuat dengan menggunakan akuadest steril dengan penambahan bahan sintetik atau bahan kimia tertentu yang mempunyai sifat atau kandungan yang hampir sama dengan air laut alami. Adapun komposisi dari ALS adalah NaCl, KCl, MgSO4, MgCl2.6H20, Tris (Hydroksi methyl-Aminomethane), akuades, CaCl2.2H2O, NH4Cl, K2HPO4, FeSO4. Setelah bahan tersebut dilarutkan dalam aquadest dilanjutkan dengan pembuatan medium pertumbuhan dengan komposis yakni 0,2 ml FeSO4, 0,4 ml K2HPO4, dan 1 ml petrolium (sumber nutirisi) yang dilarutkan dalam masing-masing 100 ml ALS 32 ‰, Setelah itu mengambil 3 ml sampel sedimen dan permukaan dan dipindahkan ke medium pertumbuhan dan diinkubasi selama 5-7 hari pada shaker (suhu kamar). Diamati perubahan yang terjadi.
Sebelum diinkubasi terlihat 2 lapisan pada labu Erlenmeyer. Lapisan atas merupakan petroleum sedangkan lapisan bawah adalah ALS. Hal ini terjadi karena perbedaan massa jenis dari kedua jenis larutan tersebut. Setelah inkubasi pada shaker selama 5-7 hari diperoleh hasil pada Erlenmeyer 1 petroleum terlihat lengket di dinding dan bakteri kurang mampu mendegradasi hidrokarbon petroleum. Bakteri tidak mampu mengemulsikan petroleum dengan ALS. Hal ini terjadi disebabkan perbedaan nutrient pada mikroba sehingga mikroba tidak mampu untuk tumbuh dengan baik.
IV.4 Proses biodegradasai hidrokarbon oleh bakteri laut
Hasil yang efektif pada isolasi bakteri, dikulturkan pada salinitas berbeda yakni 11 ‰, 23 ‰, dan 32 ‰ . Dari hasil pengamatan, didapatkan bahwa bakteri pendegredasi HC yang paling efektif yakni pada bagian permukaan air laut pada pelabuhan Paotere.
Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa bakteri paling efiensi mendegredasi HC pada salinitas 23 ‰. Sampel 23 ‰ ini yang menjadi bahan untuk teknik pewarnaan gram, untuk mengetahui karakteristik dari bakteri laut pendegredasi HC. Salah satu faktor yang mempengaruhi tingkat pendegredasian HC oleh bakteri adalah salinitas atau kadar garam. Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa bakteri laut efisien mendegredasi HC pada salinitas 23 ‰. Hal ini diakibatkan karena bakteri pendegredasi HC tumbuh optimal pada salinitas 23 ‰. Salinitas ini memungkinkan hidrokarbon tersebut digunakan sebagai nutrien bagi bakteri pendegredasi HC. Dalam pengamatan tampak bahwa Petroleum terlihat melekat di dinding labu dan tidak mampu bercampur dengan ALS hanya tampak kekeruhan. Hal ini disebabkan bakteri tidak menghasilkan biosurfaktan yang mampu mengemulsi petroleum dam ketersediaan nutrient kurang sehingga bakteri tidak mampu tumbuh dan berkembang biak. Petroleum membeku karena suhu ruangan yang rendah akibat penyalaan AC. Faktor-faktor yang dapat mempercepat terjadinya proses biodegradasi adalah :
· Penambahan nutrient
· Jumlah sel mikroorganisme pendegradasi hidrokarbon
· Penggunaan biosurfaktan
IV.5 Karakteriristik bakteri Laut pendegredasi HC
Dari pengamatan yang telah diperoleh dari pewarnaan gram di bawah mikroskop didapatkan hasil bahwa bakteri laut pendegredasi HC cenderung bersifat gram negatif, berbentuk basil atau batang dan ukurannya lebih kecil dari darat. Bakteri mempunyai daya mengikat cat utama yang lemah sehingga pada saat diberi cat peluntur bakteri akan berwarna pucat karena melarutkan lipida dan menyebabkan pori-pori dinding sel membesar sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan Kristal violet-yodium. Hal ini sesuai dengan Pernyataan oleh Austin, 1989 bahwa bakteri umumnya bersifat gram negatif, berbentuk basil atau batang dan ukurannya lebih kecil dari darat.
Dari hasil pengecatan yang dilakukan oleh kelompok kami hanya 1 yang tampak di bawah mikroskop karena terjadi kesalahan dalam pengerjaannya yaitu pada saat fiksasi yang terlalu lama di atas Bunsen sehingga menyebabkan bakteri namapak gosong. Bakteri yang dapat dilihat dibawah mikroskop diperoleh ciri-ciri bentuk bakteri laut yang berukuran kecil dan berwarna merah karena mengikat cat utama yaitu kristal violet (Gram A) sehingga dapat dilunturkan oleh cat peluntur yaitu larutan JKJ (Gram C), dan dapat diwarnai dengan cat lawan yaitu larutan safranin (Gram D). Hal ini disebabkan oleh kandungan lipid yang dikandung oleh bakteri gram negatif sedikit sehingga sangat mudah untuk dilunturkan.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
V.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Pembuatan ALS dilakukan dengan mencampurkan NaCl 23 g/l, KCl 0,75 g/l, MgSO4 3,91 g/l, MgCl2.6H20 10,85 g/l, Tris (Hydroksi methyl Aminomethane) 6,05 g/l, CaCl2.2H2O 1,47 g/l, NH4Cl 3,74 g/l ke dalam 1000 ml akuades.
2. Teknik isolasi bakteri laut pendegredasi hidrokarbon dimulai dari pembuatan ALS, medium pertumbuhan dengan penambahan petrolium sebagai nutrisi tambahan, pengujian bakteri laut pada berbagai salinitas, pewarnaan gram, dan pengamatan di bawah mikroskop.
3. Mikroba yang mampu mendegradasi hidrokarbon adalah pada sampel air permukaan pelabuhan Paotere yang diisolasi pada ALS 23 ‰.
4. Bakteri mampu mendegradasi senyawa hidrokarbon dengan memanfaatkan senyawa tersebut sebagai sumber karbon dan energi yang diperlukan bagi pertumbuhannya.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar